摘要：
目的 应用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP),通过条件优化,提高VLP的表达量,纯化后检测其免疫原性.方法 对CVA16结构蛋白基因P1及蛋白酶基因3CD进行密码子优化,插入启动子P10改造为CMV的重组杆状病毒表达载体pFastBac Dual-CMV中,获得重组穿梭质粒pFastBac Dual-CMV-P1-3CD,转化DH10 BacTM Competent Cells,提取重组杆粒Bacmid-CMV-P1-3CD,转染Sf9细胞,组装成重组杆状病毒AcMNPV-CMV-P1-3CD,并进行扩增,采用间接免疫荧光法、Western blot法及透射电镜观察对表达产物进行初步鉴定.对重组CVA16 VLP的表达条件(病毒接种MOI值、感染时间及细胞培养方式)进行优化后,通过20％蔗糖垫层及氯化铯连续密度梯度离心法纯化CVA 16VLP,并通过腹部皮下注射免疫ICR小鼠3次,采用间接ELISA法检测小鼠血清特异性IgG抗体滴度,微量中和试验法检测血清中和抗体滴度.结果 重组杆状病毒AcMNPV-CMV-P1-3CD经PCR及测序鉴定证实组装成功;重组CVA16 VLP在Sf9细胞中成功表达,优化的表达条件为:重组杆状病毒AcMNPV-CMV-P1-3CD按MOI=5接种,Sf9细胞采用悬浮培养方式悬浮培养96 h,收集细胞及培养上清;纯化的CVA16 VLP纯度可达90％以上,针对VP2的单克隆抗体能与VP0及VP2发生特异性反应,电镜下可见大量形态规则的类球形VLP,直径约为27 nm;纯化的CVA16 VLP免疫ICR小鼠后,诱导机体产生的特异性血清IgG滴度可达1∶105,中和抗体滴度达1∶358.结论 应用杆状病毒表达系统成功表达了CVA16的P1和3CD蛋白,并组装形成完整的VLP;通过质粒启动子的改造及表达条件的优化,有效提高了CVA16 VLP的表达量;纯化的CVA16 VLP可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,为CVA16亚单位疫苗的研究提供了参考.
