目的 观察三明治构型大鼠原代肝细胞长期培养的形态学变化,并对其功能进行测定.方法 采用改良原位两步法门静脉胶原酶灌注分离单肝细胞,台盼蓝拒染实验观察细胞活力,利用三明治培养构型培养成年大鼠原代肝细胞,倒置显微镜下连续观察肝细胞的形态学变化,定期收集培养细胞上清液,检测所培养肝细胞的分泌及生物转化功能,并与单层胶原培养肝细胞比较.结果 平均每个鼠肝可获取(2～3)×108个肝细胞,存活率为(93±3)%;体外肝细胞培养第3天,细胞活力、清蛋白分泌功能恢复到最佳状态;三明治构型培养第7天,地西泮24 h代谢量达到最高峰.三明治构型培养的肝细胞形成肝索样结构,并逐渐形成胆小管网络;在培养的21 d内,清蛋白分泌、地西泮代谢始终维持较高的水平;肝细胞形态维持可达28 d以上.结论 三明治构型肝细胞培养体系更接近于肝细胞体内生长环境,肝细胞可在较长时间内保持良好的形态结构和功能.三明治构型不仅可以应用于肝细胞的基础研究,而且为肝细胞移植和生物人工肝治疗肝衰竭奠定了一定的基础.