摘要：
目的:探讨人心肌肌球蛋白轻链(2v)基因启动子(pMLC2v)驱动的绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Luc)报告基因慢病毒载体在人脐带间充质干细胞(hUCMSC)向心肌样细胞分化中的表达.方法:酶消化法原代分离培养hUCMSC,采用流式细胞仪鉴定分析其细胞表面标记物及检测体外向成骨细胞、成脂细胞、内皮细胞诱导分化潜能;经5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导hUCMSC定向分化成心肌样细胞;诱导细胞并同时转染pMLC2v-GFP,于d3,d7,d10,d14,d17及d21时间点在荧光显微镜下观察及流式细胞仪检测其阳性率;用生物发光检测仪检测相同时间点的萤光素酶(pMLC2v-Luc)报告基因慢病毒载体转染分化细胞发光特征;在激光共聚焦显微镜下观察pMLC2v-GFP及红色荧光蛋白(RFP)共转染诱导21d后分化细胞蛋白的表达分布状况;与鼠心肌细胞作为对照,脉冲电流激发细胞收缩和细胞内及细胞间的钙离子流,以检测诱导分化细胞“兴奋-收缩”偶联功能;Western blot法检测诱导分化细胞pMLC2v蛋白的表达.结果:原代培养的P3 hUCMSC,经FCM检测CD90、CD105及CD73阳性率均为99％以上为高表达;获得的细胞分别经体外诱导能够向成骨细胞、成脂细胞、成内皮细胞分化;经5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导hUCMSC同时并转染pMLC2v GFP,在荧光显微镜下观察并用流式仪检测GFP表达阳性细胞数随诱导时间的延长而增加(P＜0.05);生物发光检测仪检测诱导细胞pMLC2v-Luc表达同样呈阳性递增;pMLC2v GFP及RFPC共转染诱导21d后分化的细胞,细胞浆内形成较清晰的与细胞长轴平行的肌束样结构;诱导后的细胞用共聚焦显微镜检测无细胞内及细胞间的钙离子流动;随诱导时间的延长pMLC2v蛋白表达明显增加(P＜0.05).结论:在hUCMSC体外诱导形成心肌样细胞过程中,pMLC2v基因随诱导时间的延长而表达增加,为监测干细胞的移植在心肌疾病治疗中提供了实验依据.
