摘要：
目的 初步探讨耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis毒素抗毒素(toxin antitoxin,TA)系统基因的功能及其在细菌药物耐受中的作用.方法 利用无水四环素(ATc)诱导穿梭质粒构建毒素基因(MSMEG_3436和MSMEG_6760)表达系统,检测毒素基因表达的抑菌作用.应用CRISPR-Cas12a基因编辑技术构建△MSMEG_3435-3436和△MSMEG_ 6762-6760敲除菌株,探究毒素抗毒素系统对菌株生长的影响.通过计算菌株存活率检测MSMEG_3435-3436基因对异烟肼(96 μg/ml)和利福平(40 μg/ml)的耐受相关性.在耻垢分枝杆菌中用LacZ报告基因分别替换毒素抗毒素基因(MSMEG_1277-1278、MSMEG_1283-1284、MSMEG_3435-3436、MSMEG_4447-4448和MSMEG_5635-5634),构建5个启动子活性检测突变菌株(SY3328、SY3309、SY6407、SY3310和SY3311),并将pMV261空载体和pMV261抗毒素系列质粒分别电转至5个突变菌株中,通过测定吸光度值(A600、A550和A420)计算β-半乳糖苷酶活性[酶活性单位为“Miller单位(MU)”],以检测毒素抗毒素系统的启动子活性.结果 在耻垢分枝杆菌中,ATc诱导表达毒素基因MSMEG_ 3436可抑制细菌生长,而同时表达对应的抗毒素基因MSMEG_ 3435可消除抑制作用;ATc诱导表达毒素基因MSMEG_ 6760未发现明显的抑菌作用.与野生株相比,△MSMEG_ 3435-3436和△MSMEG_6762-6760敲除菌株在7H9液体培养基中生长表型无明显差异.野生株和△MSMEG_3435-3436敲除菌株经异烟肼和利福平处理后的存活率[分别为(4.38±1.48)％和(3.49±0).66)％,(0.15±0.04)％和(0.03±0.02)％]显示毒素抗毒素基因MSMEG_3435-3436与药物耐受性无关(t=0.548,P=0.613;t=2.663,P=0.056).启动子(SY3328、SY3309、SY6407、SY3310和 SY3311)在携带pMV261-空载体和pMV261抗毒素表达质粒的报告菌株中的β半乳糖苷酶活性分别为(376.50±17.13)和(315.50±20.71)、(189.00±12.24)和(160.70±9.89)、(225.20±9.95)和(211.70±2.57)、(221.40±12.07)和(186.60±13.17)、(179.10±5.87)和(127.70±19.21) MU,差异均无统计学意义(t=2.272,P=0.086;t=1.795,P=0.147;t=1.319,P=0.258;t=1.949,P=0.123;t=2.562,P=0.063).结论 成功构建了MSMEG_3435-3436和MSMEG_ 6762-6760在耻垢分枝杆菌中的诱导表达体系及敲除菌株,并发现MSMEG_3435-3436足一个新的有功能的毒素抗毒素系统,以及这两个毒素抗毒素系统与菌株生长表型及异烟肼和利福平耐受性无关,最后发现耻垢分枝杆菌中5对毒素抗毒素系统的抗毒素基因可能在自身启动子调控中不发挥关键作用,可为进-步研究结核分枝杆菌毒素抗毒素系统的功能提供线索.
