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CRISPR/Cas9基因编辑系统中两种gRNA活性检测方法比较

The comparison of two methods for detection of gRNA activity in CRISPR/Cas9 system

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收录情况: ◇ 统计源期刊

机构: [1]100029北京市心肺血管疾病研究所-首都医科大学附属北京安贞医院心血管重塑相关疾病教育部重点实验室科研基地建设-心血管重大疾病协同创新中心
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关键词: CRISPR/Cas9 gRNA活性 Surveyor/T7E1检测 体外检测

摘要:
目的:比较CRISPR/Cas9系统中gRNA活性检测的两种方法,即利用Surveyor/T7E1核酸酶检测方法或利用Cas9蛋白的体外检测方法.方法:一方面构建表达Cas9和特异gRNA的质粒,转染NIH3T3细胞,然后提取DNA,利用T7E1核酸内切酶检测gRNA介导Cas9切割靶DNA并产生indel突变的效率;另一方面,设计引物并利用PCR扩增出gRNA的DNA模板片段,通过体外转录获得gRNA,利用Cas9蛋白及gRNA进行体外反应检测切割效率.结果:利用Cas9蛋白体外酶切可以检测到较高的gRNA活性,然而通过T7E1核酸酶方法检测gRNA在细胞中活性整体偏低,且在不同基因之间差异较大.结论:细胞Surveyor/T7 E1法与Cas9蛋白体外酶切法检测到的gRNA活性不完全一致,体外活性检测法不能替代.

基金:
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第一作者:
第一作者机构: [1]100029北京市心肺血管疾病研究所-首都医科大学附属北京安贞医院心血管重塑相关疾病教育部重点实验室科研基地建设-心血管重大疾病协同创新中心
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