摘要：
目的 探讨适用于犬心房肌成纤维细胞(CAF)体外分离培养及鉴定的技术方法.方法 无菌手术取犬左心耳,应用木瓜蛋白酶、Ⅰ型胶原酶联合消化法分离心房肌成纤维细胞并进行体外培养.在倒置显微镜下观察原代心房肌成纤维细胞生长特点;苏木精-伊红(HE)染色观察细胞形态,并对细胞进行纤维连接蛋白、波形蛋白、盘状结构域受体2蛋白免疫荧光染色;通过绘制生长曲线法、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2-四唑单钠盐(WST-8)法观察细胞的增殖情况;流式细胞仪分析比较各代细胞DNA周期特点;观察不同培养体系对第3代(P3) CAF生长的影响.结果 酶联合消化法分离培养的细胞1d后,可见细胞贴壁呈长椭圆形生长,3d后生长迅速呈长梭形,7d后细胞排列成单层,连接紧密;HE染色显示细胞长梭形呈螺旋状排列;免疫荧光检测纤连蛋白、波形蛋白、盘状结构域受体2表达阳性;P1、P2、P3细胞生长曲线近似“S”形,WST-8法显示P1、P2、P3细胞生长于第3天至第5天光密度值变化较明显,增殖迅速;P1、P2、P3 G0/G1的百分率分别为(56.83±1.72)％、(68.10±1.33)％、(68.23±1.33)％,各代之间G0/G1的百分率比较差异无统计学意义(P ＞0.05);P1、P2、P3(S+ G2)/M的百分率分别为(43.17±1.72)％、(31.90±1.33)％、(31.77±1.33)％,各代之间(S+G2)/M的百分率比较差异无统计学意义(P＞0.05);杜尔伯克改良伊格尔/F12培养基培养的P3细胞增殖力明显高于RPMI-1640培养基培养的细胞,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 酶联合消化法可以高效快速分离和稳定培养CAF,为研究犬心房纤维化提供了充足的种子细胞.
