目的:建立成年大鼠胰腺非胰岛内Nestin阳性细胞的体外分离培养及分化的方法.方法:采用胰管内注入胶原酶消化法分离3只成年大鼠胰腺组织,并经含10%胎牛血清RPMI 1640液(pH 7.6)体外培养,36 h后弃去悬浮细胞及胰岛,改用无10%胎牛血清RPMI 1640液(pH 7.4)加bFGF、EGF及N2添加剂培养,18～22 d后收集新生类胰岛样细胞团并传代培养.挑选新分离的胰岛和新生类胰岛样细胞团每次各40个,共3次,采用131 I放射免疫法测定分离的胰岛及新生类胰岛样细胞团的胰岛素分泌量,并计算葡萄糖刺激指数(SI);免疫荧光细胞化学法检查贴壁细胞及传代后的新生类胰岛样细胞团Nestin阳性细胞的表达.结果:胰管内注入胶原酶消化法可获得功能、形态良好的胰岛;分离后胰腺组织在pH 7.6的10%胎牛血清RPMI 1640液培养条件下,36 h内胰岛细胞不贴壁,贴壁细胞中大多数表达Nestin阳性细胞,无胰岛素和胰高血糖素表达,但Nestin表达不一,培养18～22 d可见新生类胰岛样细胞团出现,新生类胰岛样细胞团传代后仍可见Nestin阳性细胞.新分离的40个胰岛在含糖3.3、16.7 mmol·L-1培养液中胰岛素分泌量为(63.6±4.0)、(202.2±14.8)mIU·L-1;而新生的40个类胰岛样细胞团胰岛素分泌量为(3.5±0.2)、(3.3±0.2)mIU·L-1,差异有显著性(P＜0.001).结论:胰管内注入胶原酶消化法可获得功能、形态良好的胰岛;在pH 7.6条件下可分离培养出成年大鼠胰腺非胰岛内Nestin阳性细胞,经无血清培养形成的类胰岛样细胞团,可传代培养,并表达胰岛素.胰腺非胰岛内Nestin阳性细胞具有胰腺干细胞特点.